新兴疫苗技术：外膜囊泡疫苗 & RNA疫苗
本文节选自《Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacutrue》，更多详细内容，请参考原文或往期公众号文章《用于低成本、快速疫苗生产的新兴技术》以及《用于疫苗开发的高产量酵母及杆状病毒-昆虫细胞平台》。
外膜囊泡疫苗，用于膜抗原疫苗生产的通用模块
外膜囊泡(OMV)是所有革兰氏阴性菌在生长过程中自然产生的。革兰氏阳性菌、分枝杆菌和古细菌也能自然释放OMV。OMV是起源于内吞的球形实体，直径通常在20-250nm之间。这些病毒大小、带有镶嵌蛋白的脂质双层囊泡具有很高的免疫原性。基于OMV的疫苗可通过以下方法生产：a)培养自然分泌OMV的野生型细菌；b)在EDTA存在下，使用脱氧胆酸钠进行去垢剂提取；c)培养转基因细菌，以提高OMV产量。去垢剂提取可以去除能产生反应的或有毒的脂多糖，但其缺点在于：1)失去带负电荷的表面抗原；2) OMV可能聚集，导致大小不均匀，在除菌过滤过程中会损失一部分OMV；3) OMV疫苗因细菌细胞裂解而被其细胞质蛋白污染。为了克服这些限制，可对产生OMV的细菌进行基因工程处理，以提高OMV疫苗的生产。这些基因工程修饰方式包括：1)改变细菌脂多糖生物合成途径，以降低内毒素和反应原性；2)抗原的过表达；3)多种抗原和抗原异构体的同时表达；4)分泌的抗原截留在外膜中；5)通过去除外膜锚定蛋白，增强OMV生成；6)去除可能引发不良免疫反应的免疫调节成分。细胞壁内外膜的完整性和黏附，通常由Tol- Pal系统调控，该途径的修饰可被开发用于增强OMV的生成。
膜抗原的通用模块(GMMA)是工程化的OMV，以增强自然OMV的形成(通过删除脑膜炎球菌中的gna33以及索奈氏痢疾杆菌和沙门氏菌中的tolR)，降低反应性和毒性(通过修饰脂质A的酰化模式)和过表达免疫原性抗原。GMMA含有病原体相关的分子模式，包括toll样受体配体，在其诱导的免疫应答中，其可作为自我佐剂。GMMA具有高免疫原性、高效、低反应原性、安全、且可在可放大的工艺中以低成本方式进行生产。GMMA的主要限制是不能进行人体翻译后修饰(如糖基化)。GMMA的生产规模已经扩大，用于生产符合GMP质量要求的志贺氏菌和非伤寒沙门氏菌疫苗。本文描述了在志贺氏菌中进行GMP质量GMMA的生产，因为这种基于GMMA的疫苗已经开发到最先进的阶段，在成人临床试验中被证明是安全的，且具有免疫原性。从用于发酵的菌种解冻到最终纯化的GMMA的生产时间为3天，因此，根据疫苗剂量的大小，一个拥有500L发酵罐的相对较小的生产工厂，每年可生产超过10亿剂疫苗。以GMMA为例的OMV疫苗生产方案如下图所示。
使用革兰氏阴性菌生产GMMA疫苗。GMMA在细菌培养过程中不断释放，并使用两个连续的TFF步骤进行分离。
上游和中游工艺
目的菌株经过基因工程处理，以获得GMMA疫苗生产所需的特性。对此，在志贺氏菌中，抗生素选择标记取代了tolR、galU和msbB1基因。对于在沙门氏菌中进行的GMMA疫苗生产，可以删除tolR、msbB、htrB和pagP基因，并使用抗生素选择标记替代。获得的菌株被储存在双层细胞库中，然后扩增，以用于生产。与动物细胞相比，细菌生长得更快，可以在更大体积的生物反应器中培养，因为细菌细胞比动物细胞更强健，能够承受更高的压力和搅拌速率。
一旦获得所需的接种液体积，细菌被接种到补料分批生产生物反应器中。细菌发酵罐的体积可达数百立方米，体积达2,000m3的发酵罐也已有报导。一旦细菌到达稳定生长期，发酵液转入下游纯化阶段。
分离和纯化
发酵过程中产生的GMMA被释放到发酵液中，通过包括微滤和超滤两个连续的TFF步骤将其与其它发酵液成分分开。在第一个微滤步骤中，生物反应器与TFF系统连接，并用作循环罐，将培养上清液浓缩三倍，然后使用缓冲液进行5体积的不连续洗滤。在第二步超滤步骤中，大量可溶性蛋白质和核酸被去除。接下来，GMMA溶液浓缩至制剂过程所需的水平。
RNA疫苗生产
核酸(DNA或RNA)疫苗编码抗原，疫苗抗原在患者的细胞中产生。通过这种方式，使用正确的人特异性翻译后修饰，可以在人体内表达广泛的抗原。RNA分子或疫苗的大规模生产目前从很多方面来说还是未知的，可能带来一定挑战。
目前还没有RNA疫苗获得监管批准，但RNA反义寡核苷酸和适配体疗法已被临床批准用于调节蛋白表达。短干扰RNA(siRNA)疗法也在研发中。这些RNA疗法的“长度”比RNA疫苗短得多，然而，其为RNA疫苗临床获批打开了通道。RNA疫苗目前正在进行临床试验。使用自复制RNA载体替代基于mRNA的疫苗可以提高RNA疫苗的效率。因此，目前的研究主要集中在使用基于RNA依赖性RNA聚合酶（复制酶）的RNA疫苗。对于这些基于复制酶的RNA疫苗，首先复制酶被表达，从而允许RNA模板的扩增。非病毒传递方法(例如纳米颗粒)是RNA疫苗的首选，因其成本较低，易于大规模生产，且具有优化安全性的潜力。
事实上，RNA疫苗是通过纳米阳离子多聚体或脂质体剂型递送进入细胞质的。RNA的全合成制备和生产的简单性，使得其可在新病原体鉴定后几周内可产生数千剂。构建靶向菌株多样性或多个传染病靶点可以很容易地组合。此外，较低的基础设施和设备成本要求，使在低收入地区建立生产工厂的计划成为可能。因此，由于与DNA疫苗相比，自复制RNA疫苗易于使用多聚物或脂质体给药，以及其效力和非诱变特性，我们选择自我复制RNA疫苗生产进行进一步分析。该类RNA疫苗的活性药物成分是一种自我复制的RNA分子（RNA复制子）。这种RNA分子有9,000 – 12,000个核苷酸，其编码：1)一种非结构蛋白，可以自我分裂，释放复制RNA复制子所需的解旋酶和复制酶蛋白，2)目的抗原基因。在这些编码基因的两侧，复制子RNA还包含一个5' 不翻译区 (UTR)、一个3 'UTR、一个5' 帽序列以及Poly(A)尾序列。自我复制RNA分子通过体外无细胞转录反应生成，如下图所示。
使用体外转录生产RNA疫苗。编码抗原的自我复制RNA，通过体外转录从DNA模板转录，5 '帽共转录，模板DNA被消解，然后使用TFF纯化。
上游和中游工艺
首先，通过将抗原编码基因插入到RNA复制子表达序列的正确位置，生成编码全长RNA复制子的质粒DNA。RNA复制子受T7启动子控制，因此使用T7 RNA聚合酶转录。质粒DNA在大肠杆菌中扩增、纯化、并用两种限制性内切酶线性化。
体外无细胞转录(IVT)反应，使用T7 RNA聚合酶，从DNA模板转录复制子RNA，形成DNA、RNA和蛋白酶的复杂混合液。在IVT过程中，通过向反应中添加m7GpppG帽结构类似物，以及保持帽分子与RNA序列第一个核苷酸(即GTP)的摩尔比，RNA复制子的5'端可以加帽。或者，也可以使用源于牛痘病毒的加帽酶，在单独的步骤中，对RNA进行加帽。这里，潜在的成本权衡在于，是在单次IVT反应中使用昂贵的帽类似物，还是使用更便宜的加帽反应，后者需要进行额外的酶生产步骤。
5' 帽在RNA疫苗中的作用是:1)防止外切酶降解;2)促进翻译;3)规避针对RNA分子的先天免疫反应。在IVT过程中，RNA复制子的3'端可通过在DNA模板上编码poly(A)尾而被聚腺苷化。DNAse I酶被添加到IVT反应混合液中，以降解模板DNA分子。
分离和纯化
复制子RNA分子可以使用基于大小差异而进行分离的TFF技术，从反应混合液中分离出来，过滤器膜可选择聚砜、聚醚砜以及具有更高亲水性的改性聚醚砜滤膜。分子量较小的杂质(如三磷酸核糖核酸、小核酸片段、氨基酸等)可以通过膜。TFF中的跨膜压通常为2 psi左右，剪切约为800s-1左右。在TFF过程中，也可以通过将新的缓冲液注入进样容器而进行缓冲液置换(洗滤)。通常用pH在8左右、总盐浓度在250mM左右的缓冲液替代起始缓冲液。
原文：Z.Kis, R.Shattock, N.Shah, et al., Emerging Technologies for Low-Cost, Rapid Vaccine Manufacture. Biotechnology Journal, 2019, DOI: 10.1002/biot.201800376.
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